Role of Protein Tyrosine Phosphatase 1B in the Type 2 Diabetes and Obesity
WANG Chen1 WANG Li2, YANG Ze1
(1.Beijing Institute of Geriatrics, Beijing Hospital, Key Laboratory of Genetics, Ministry of Health of P. R. China, Beijing 100730, China;
2. Institute of Genetics and Developmantal Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101,China)

Abstract: PTP1B is a ubiquitously expressed intracellular protein tyrosine phosphatase. Several lines of evidence support an important role for protein tyrosine phosphatase 1B(PTP1B) in metabolism, and specially in type 2 diabetes and obesity. Overexpression of PTP1B protein has been observed in insulin-resistant states associated with obesity. PTP1B is a negative regulator of insulin and leptin signaling, PTP1B inhibitors might be efficacious in the treatment of type 2 diabetes and obesity by increasing insulin and leptin sensitivity.
Key words: protein tyrosine phosphatase 1B(PTP1B); type 2 diabetes mellitus; obesity; insulin signaling

2型糖尿病是我国中老年人的常见慢性病。我国肥胖者中有30%患有2型糖尿病。由于2型糖尿病和肥胖均属于与生活方式密切相关的多基因遗传性疾病，其发病机制尚不十分明确。近来在遗传学方面取得的研究进展中，蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）基因成为越来越引人注目的靶基因之一。
蛋白质酪氨酸磷酸化是细胞代谢、信号传导及细胞周期调控的重要调节步骤。PTP1B属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族，该家族40余种磷酸酶都具有一个约240个氨基酸组成的同源序列，位于酶催化活性部位，以跨膜受体样蛋白和胞内酶形式存在，催化蛋白质酪氨酸去磷酸化反应。PTP1B通过对胰岛素受体激酶（insulin receptor kinase，IRK）或IRK活性片段的磷酸化酪氨酸残基去磷酸化作用对胰岛素信号传导进行负调节。越来越多的证据表明：PTP1B在调节胰岛素敏感性和能量代谢的过程中均起着重要作用，通过抑制PTP1B可增加胰岛素和瘦蛋白的活性。

1 PTP1B基因结构、表达调控和蛋白质结构

1. 1 基因结构及定位

人类PTP1B基因于1990年首次克隆成功, 定位于20q13.1―q13.2，为单拷贝基因。2000年Forsell克隆并确定了人及大鼠PTP1B基因包括启动子的结构，人与大鼠PTP1B基因的结构十分相似，但人类PTP1B基因的3′末端比大鼠多一个外显子。人类PTP1B基因全长约74kb，共有10个外显子，其中内含子1长度超过54kb。其cDNA全长1305nt，编码435个氨基酸的蛋白质，分子质量为49，966Da。大鼠的PTP1B基因被定位于2号染色体的远端H2―H3区，该区域与大鼠肥胖的数量性状基因座相关联，与人类20号染色体有保守性同源序列。
小鼠和人类的PTP1B基因启动子区域均不含TATA框，但富含包括保守SP-1结合位点的GC序列。用8kb的5′侧翼序列在Hep3 G2细胞中研究PTP1B启动子活性，表明位于ATG上游的一个432bp的启动子构件能够产生最大的启动子活性。此区域至少包含3个富含GC的序列和一个CCAAT框。这些元件任何一个缺失都会导致启动子活性降低。

1．2 表达调控

人类PTP1B基因mRNA有两种选择性剪接产物。一种长约4.7kb，终止于9，另一种长3.5kb，内含子9被剪切，序列终止于外显子10。发生选择性剪接的原因目前尚不清楚。Susan等人通过对21名Pima印第安人测试后发现，在加入胰岛素培养的人成纤维细胞中可观察到两种剪接体的比率发生了变化，在单核细胞中两者的比率与血浆胰岛素浓度及体脂百分比相关联, 两种剪接体在分离的血细胞中均可表达。两种剪接体比率变化的生化意义目前仍未明确，可能是反映了信号传导水平的高低。

1．3 蛋白质结构和活性位点

PTP1B的N端是其催化结构域，C端将其锚定于内质网。PTP1B通过N端结构域与胰岛素受体结合并负调节胰岛素信号。发生于该区域的点突变虽不影响PTP1B的磷酸酶活性，但会干扰PTP1B和胰岛素受体的结合，使这一突变体不能在胞内对胰岛素受体有效地去磷酸化，从而无法有效抑制胰岛素信号。C端有一富含脯氨酸的区域，可对整合后的信号传导过程进行负调节。

2 PTP1B与信号传导

2．1 PTP1B与胰岛素信号传导

胰岛素信号传导过程十分复杂，胰岛素受体是四聚体（α2β2）分子，可以看作由两个αβ组成的二聚体。与配体结合引起受体四聚体分子的两对αβ亚基之间的别构作用，使催化结构域自身磷酸化，继而将胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate，IRS-1）的多个酪氨酸（Tyr）残基磷酸化，IRS-1的这些pTyr成为细胞内信号蛋白的高亲和力结合位点和激活位点。对该过程的调节涉及到正负调节蛋白的协同作用，在众多负调节因子中PTP1B作用突出。研究发现：与野生型大鼠相比，PTP1B基因剔除大鼠的胰岛素敏感性增加，肝脏及肌肉组织中的胰岛素受体磷酸化水平增强[6]。表明PTP1B是调节胰岛素信号的关键因子。
胰岛素受体属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)，SRC蛋白是SRC基因表达的膜蛋白，也是一种激酶，是RTK的靶蛋白。SRC蛋白结合于活化的RTK后，某些Tyr残基被磷酸化，从而激活了它的酪氨酸激酶活性。SRC蛋白有3个重要结构域：SH1-SH3。其中SH3在某些信号传导途径中介导蛋白质之间的相互作用。PTP1B基因N端串联的Tyr残基和C端富含脯氨酸的区域对于SRC激酶的激活是不可缺少的。无法正常结合胰岛素受体或SH3结构域的PTP1B突变体仍完全保留其抑制信号传导的功能。以上结果提示，PTP1B可独立调节胰岛素信号及整合后的信号。
研究表明，在体内胰岛素刺激后，胰岛素受体对多个Tyr残基进行自身磷酸化，这增强了受体固有的酪氨酸激酶活性[8]。活化的胰岛素受体短暂地结合于PTP1B，PTP1B作为活化的胰岛素受体酪氨酸激酶（insulin receptor tyrosine kinase，IRTK）的直接底物,与其结成复合物，随后PTP1B的Tyr66、Tyr152和（或）Tyr153被IRTK磷酸化，增加了它的磷酸酶催化活性。由胰岛素受体催化的PTP1B的酪氨酸磷酸化绝对依赖于胰岛素刺激后受体的自身磷酸化，并须具备一个完好的激酶结构域，包含有胰岛素受体Tyr1146、1150和1151。这一发现显示PTP1B催化活性的上调是通过增加其酪氨酸磷酸化水平实现的，由此可能强化了PTP1B对靶分子的去磷酸化作用，比如活化的胰岛素受体和IRS-1，并因此减弱或终止胰岛素的信号传导。此外胰岛素刺激的PTP1B酪氨酸磷酸化水平的增加可能也调节了PTP1B对自身的去磷酸化作用，使PTP1B回到无活性的基础状态。Stein―Gerlah等人曾报道过在对PTP1D的研究中有类似发现。但也不能排除其他PTP酶参与了调节PTP1B磷酸酶活性的可能。这些结果提示，PTP1B可能是通过维持其磷酸化或去磷酸化水平的平衡来调节其自身的活性。 PTP1B活性的调节机制到目前仍不十分清楚。由于PTP1B在体内广泛表达，人们在对不同组织中表达的PTP1B进行研究时发现，体内还有一些小分子物质，如NO、过氧化氢（H2O2）也可能参与了PTP1B活性的调节。
NO在脊椎动物中有信号分子的作用，因为它是疏水性较强的胞外小信号分子，很容易通过扩散越过靶细胞质膜，一旦进入胞内就直接调节细胞质中特异蛋白质的活性。最近有实验证实，小鼠血管平滑肌细胞中的NO可增加PTP1B的活性， NO可通过PTP1B对胰岛素信号传导下调机制减弱胰岛素刺激细胞的能动性。在胰岛素敏感的肝癌和脂肪细胞中，胰岛素刺激使胞内过氧化氢（H2O2）突然升高，PTP1B活性被抑制88%以上。表明氧化还原信号可使PTP1B氧化失活，加强了胰岛素刺激早期酪氨酸磷酸化的级联反应。

2．2 PTP1B与瘦蛋白信号传导

瘦蛋白是由OB基因编码的一种分泌性蛋白质，与瘦蛋白受体结合后可发挥调节体重和能量消耗的作用。许多肥胖以瘦蛋白抵抗为主要特征。缺乏PTP1B的瘦蛋白基因敲除（ob/ob）大鼠表现为体重不增加，脂肪组织减少及静息代谢率提高，而且对瘦蛋白介导的体重减轻和食欲抑制有增强效应。PTP1B在大鼠下丘脑瘦蛋白应答神经元聚集区表达，实验表明，PTP1B可通过对瘦蛋白受体相关激酶JAK2的去磷酸化作用引起瘦蛋白抵抗。

3 PTP1B与糖尿病和肥胖

2型糖尿病属于多因子病，由于其遗传异质性及多因子参与发病，其遗传机制目前并不十分清楚。2型糖尿病的主要特征是胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是指胰岛素作用的靶器官或靶组织，如肝脏、肌肉、脂肪组织等对一定量的胰岛素的生物学反应低于预计正常水平。因此了解PTP1B在胰岛素信号传导中的作用途径，以及调节PTP1B活性的机制可为治疗胰岛素抵抗和2型糖尿病提供理论依据。

3．1 PTP1B的多态性与糖尿病

目前已发现多个PTP1B的单核苷酸多态性（SNPs）。其中1个多态位于5′端非翻译区，4个多态位于3′端非翻译区。除3′端非翻译区的1484insG等位基因频率为7.7%外，其他多态性的等位基因频率都在12%。另外还有外显子6的沉默突变A669G，外显子8的沉默突变C981T和外显子9的一个错义突变C1207T(Leu379Phe)。另两处突变分别发生于内含子3和内含子5。其中1484insG和C981T均已有报道与糖耐量异常（IGT）或2型糖尿病的风险相关。
Di Paola使用PCR―SSCP方法在PTP1B的编码区及调节区寻找多态。在意大利两个不同人群中确定了在3′非翻译区的1484insG变异与胰岛素抵抗的几项指标有关。通过对基因型不一致的同胞对进行家系相关研究也得到了同样的结论。携带1484insG的受试者骨骼肌中的PTP1B mRNA呈现过度表达。在人胚肾细胞中分别转染1484insG PTP1B和野生型PTP1B，前者mRNA的稳定性显著高于后者。因此，携带1484insG基因型的个体可能对于治疗胰岛素抵抗的PTP1B抑制剂比较敏感。
2002年Mok在加拿大的Oji―Cree人群中发现了一个位于外显子8的单核苷酸多态（SNP），命名为981CT。在该人群中，这一SNP与患IGT和2型糖尿病的风险都有相关性。经测定，653名受试者中有68人是杂合子，无一例981T/981T纯合子。C等位基因频率为0.948，T等位基因频率为0.052。基因型为981T/981C的受试者与基因型为981C/981C的受试者相比，患IGT或2型糖尿病的可能性降低了约40%（P=0.040）。但在根据PTP1B 981CT基因型区分的受试者组群之间并没有数量形状的差异。数据表明，PTP1B基因的变异可能与降低糖尿病患病风险相关Di Paola 也发现了这一SNP，T等位基因频率为7%，但未见报道与糖尿病相关。

3．2 PTP1B与肥胖

发生于其靶组织中，如肝脏、骨骼肌和脂肪细胞中的胰岛素信号通路缺陷是人类肥胖病因的主要特征之一，并导致超重人群中2型糖尿病的发病率逐步上升。研究表明，肥胖者体重减轻后胰岛素敏感性得到改善，同时他们脂肪组织中的PTP1B活性也相应下降。在胰岛素抵抗者中也观察到PTP1B过表达与肥胖相关。PTP1B基因敲除大鼠的肝脏和骨骼肌中胰岛素敏感性增高，而脂肪中并未增加。但这种大鼠却可抵抗高脂膳食诱导的体重增加。PTP1B在肥胖动物的脂肪组织中所起的作用引起了人们的兴趣。
研究人员用PTP1B反义核苷酸（PTP1B ASO）治疗胰岛素抵抗的高血糖肥胖（ob/ob）大鼠后发现，伴随脂肪中PTP1B水平的下降肥胖程度明显减轻。PTP1B ASO通过调低一系列涉及编码脂肪生成的基因的表达水平使脂肪细胞中的甘油三酯含量下降。编码脂肪生成的基因表达产物主要有甾醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element binding protein 1，SREBP1）、其下游靶蛋白spot14、脂肪酸合成酶以及其他脂肪生成基因的产物：脂蛋白酯酶、过氧化物增殖体激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor gamma ，PPARγ）等。其中PPARγ可以通过对解偶联蛋白（uncoupling proteins,UCPs）表达水平的上调减少肥胖的发生。
SREBP1属于转录因子。目前认为它与脂肪细胞能量储存、肥胖增加有关，可能调节着几种与脂肪酸和甘油三酯代谢有关的重要基因。在用PTP1B ASO治疗的ob/ob大鼠的脂肪组织中，SREBP1及其下游靶基因的表达均调低，该效应可导致脂肪生成减少。此外，SREBP1的表达在一定程度上依赖于PPARγ。最近发现，SREBP1可通过内源性配体或PPARγ1和3的启动子激活PPARγ并刺激瘦蛋白的表达。肥胖不仅涉及脂肪细胞大小的增长，而且与脂肪细胞数量有关。SREBP1可以通过加强PPARγ的转录活性，增加被分化成脂肪细胞的细胞的百分比。PTP1B在脂肪组织中的减少调低了SREBP1和PPARγ的表达，一方面使与脂肪形成有关的基因表达减少，脂肪数量降低；另一方面使可分化至脂肪细胞的前体细胞的数量减少。现已发现，在体外SREBP1基因的表达可被胰岛素和葡萄糖水平调高，但这些因素在体内对SREBP1的调节效应仍存在争议。

4 PTP1B作用研究的临床价值

PTP1B通过去磷酸化作用影响了胰岛素和瘦蛋白信号传导，对胰岛素抵抗和肥胖的发生起重要作用。寻找高效高选择性的PTP1B抑制剂为治疗2型糖尿病和肥胖开辟了新的途径。目前研究人员已在这方面取得了较大进展。近来发现在PTP1B启动子序列内有一增强子序列是转录因子YB―1(Y box―binding protein-1)的结合位点，用特异的反义核苷酸抑制YB-1表达可导致PTP1B表达水平下降约70%，对胰岛素敏感性加强，同时与PTP1B结构非常相似的TC―PTP的表达水平却未受影响，显示YB-1在有效抑制PTP1B表达的同时具备较好的选择性。Compound 2是到目前为止报道的作用最强的选择性PTP1B抑制因子，在确定了与Compound 2形成复合物的PTP1B的晶体结构后发现，PTP1B的Lys41、Arg47及Asp48组成了临近PTP1B活性位点的特有的非催化位点，该区域的确定为挑选高效高选择性的PTP1B抑制剂提供了新的结构基础。
PTP1B在胰岛素和瘦蛋白信号传导中的作用途径和调节机制尚未完全明确，它可能是从不同层面、不同环节发挥其作用。继续深入这方面的研究不但可以阐明PTP1B的生理功能,而且为治疗2型糖尿病、肥胖提供了光明前景。